一株于海泥的放线菌S1001发酵产物具有致细胞坏死活性，本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLC等分离手段对该菌株发酵产物的活性部位进行了活性追踪分离，共分离得到8个化合物，通过理化性质及波谱学手段，鉴定其结构分别为4′，5，7三羟基异黄酮，4苯甲酸，环，环，环，环，环，环。并用SRB法初步评价了化合物1～8的抗肿瘤活性，结果表明化合物4、5和7在10μmol/L浓度时对K562细胞表现出了一定的抑制活性。
海洋放线菌；次级代谢产物；异黄酮；环二肽；抗肿瘤活性
TheantitumoractivecomponentfrommarinederivedactinomyceteS1001
KEYWORDSMarineactinomycete;Secondarymetabolites;Isoflavone;Cyclodipeptides;Antitumoractivity
海洋微生物由于生活在高盐、高压及寡营养的特殊环境中，具有独特的代谢方式，因此能产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。近20年来，有关海洋微生物产生新的活性次级代谢产物的报道逐渐增多，海洋微生物作为活性物质的新正日益被国内外海洋研究工重视。本实验室以小鼠乳腺癌tsFT210细胞为活性筛选模型，对我国青岛沿海采集的海泥样品中分离纯化的微生物菌株进行筛选，得到一株放线菌S1001具有坏死性细胞毒作用。为阐明它的抗肿瘤活性成分，采用活性追踪的方法，对其发酵物进行研究，迄今为止，共分离得到9个化合物，利用理化性质和波谱学方法鉴定了其中8个化合物。本文着重报道化合物1～8的提取分离，结构鉴定及活性研究。
1材料与方法
1.1试验试剂和仪器熔点用日本Yanaco公司MP500D型显微熔点仪测定；质谱用QTOFULTIMAGLOBALGAA076LC型质谱仪，核磁共振谱用日本JEOLJNMECP600型核磁共振仪测定；制备用高效液相色谱仪采用日本岛津公司产品；SephadexLH20和层析用硅胶H分别为Pharmacia公司和青岛海洋化工厂产品；活性测试采用小鼠温敏型乳腺癌tsFT210细胞；胎牛血清和RPMI1640细胞培养基分别为Hyclone公司和GIBCOBRL公司产品。磺酰罗丹明B为Sigma公司产品。
1.2菌株的分离与培养
1.2.1产生菌株放线菌S1001从青岛沿海的海泥中分离得到，其发酵液的总提物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞表现出坏死性细胞毒活性。
1.2.2培养从28℃培养4d的高氏1号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基，于28℃，120r/min的条件下摇床培养2d得到种子培养液。将该种子培养液按10%的接种量，接种于150瓶每瓶含100ml液体培养基的500ml三角瓶中，28℃，120r/min摇床培养5d，发酵15L。
1.3活性测试
1.3.1生物活性测试方法按照文献采用SRB法，结合显微镜观察细胞形态变化。
1.3.2有效部位的确定取发酵液1ml，减压浓缩蒸干，然后溶于甲醇，该甲醇提取物在1mg/ml的浓度下，显示了强的坏死性细胞毒抗肿瘤活性。将甲醇提取物配制成10mg/ml的蒸馏水混悬液，取混悬液三份分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只有乙酸乙酯萃取物具有与粗提物相应的生物活性，故确定为有效部位。1.4提取分离培养物用滤纸抽滤，分为上清液和菌丝体两部分。上清液15L浓缩至约5L，等体积乙酸乙酯萃取三次；菌丝体先用80%丙酮提取，提取液浓缩至无丙酮后所得的水相再用等体积乙酸乙酸萃取三次，合并两部分的乙酸乙酯萃取物得总浸膏2.6g。浸膏拌硅胶过柱，以石油醚∶丙酮、氯仿∶甲醇梯度洗脱，各馏分，减压浓缩、合并，得到9个色谱组份Fr1～Fr6。每个组分经活性测试，确定Fr3、Fr4和Fr6为活性组分。经反复的正反相硅胶、SephadexLH20柱色谱和高效制备液相色谱等分离手段，从Fr3得到化合物2、6，从Fr4得化合物1、5、7，从Fr6得化合物3、4、8。
2结果与讨论
2.1化合物结构鉴定化合物1无色针晶，ESIMS：m/z269-。1HNMRδ：8.04，735，682，632，620；13CNMRδ：1822，1659，1638，1597，1588，1548，1313，1247，1233，1162，1062，1001，947，参照文献确定结构为4′，5，7三羟基异黄酮。化合物2无色针晶，ESIMS：m/z274+。1HNMRδ：805，736，693，685，684，结构鉴定为4苯甲酸。化合物3白色粉末，1HNMRδ：400，391，142；13CNMRδ：1716，1687，517，454，194，参照文献确定结构为环。化合物4无色片状结晶，1HNMRδ：423，409，372，348～357，229～233，200～204，190～198，确定结构为环。化合物5无色针晶，1HNMRδ：690，664，406，344，301，269，142，075，012，064，064；13CNMRδ：1674，1662，1564，1312，1259，1149，557，522，437，377，229，228，213，参照文献确定结构为环。化合物6无色针晶，1HNMRδ：397，381，230，184，166～175，104，094；13CNMRδ：1716，1702，612，542，431，336，252，233，225，188，169，结合文献确定结构为环。化合物7无色针晶，1HNMRδ：393，376(1H，dd，J=40，13Hz，H3)，221，185，173，159，104，096，095，094，结合文献确定为环。化合物8无色针晶，1HNMRδ：725～729，717，406，334，309，287，274，结合文献并与实验室已有样品对照确定结构为环。
2.2抗肿瘤活性采用SRB法并结合显微镜检测细胞形态学变化，测定了化合物1～8对人慢性髓原白血病细胞K562肿瘤细胞的抑制活性，结果表明环二肽类化合物4、5和7在10μmol/L时即能观查到细胞坏死活性，抑制率分别为15.4%、19.3%和18.6%，其他化合物在100μmol/L高浓度时也未检测到相关活性。
3讨论
本文采用活性追踪的方法从一株海洋放线菌S1001的活性部位分离鉴定了1个异黄酮类化合物，1个苯甲酸类衍生物，以及6个环二肽类化合物，并经活性测试阐明了环二肽类化合物为该菌株的主要活性相关成分。文献报道也显示环二肽类化合物可作为免疫功能调节剂和抗肿瘤制剂，并且体内体外试验证明均有效，值得进一步研究。菌株S1001的次级代谢产物比较单一，主要为环二肽类化合物且产量较大，因此可以考虑作为环二肽的生产菌株加以利用。
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